Huấn luyện cây giống nuôi cấy mô: Từ phòng thí nghiệm tới đồng ruộng[1]
Lược dịch: TS. La Việt Hồng
Viện Nghiên cứu Khoa học và Ứng dụng, trường ĐHSP Hà Nội 2
Tóm tắt
Sự thành công của một quy trình vi nhân giống ở quy mô công nghiệp phụ thuộc vào khả năng chuyển cây con nuôi cấy mô ở mức độ rộng, giá thành rẻ và có tỷ lệ sống cao. Trong suốt quá trình chuyển cây con in vitro ra đồng ruộng, cây con không có khả năng cạnh tranh với các vi khuẩn đất và chống chịu với các điều kiện môi trường. Các điều kiện nuôi cấy in vitro thường làm cho cây nuôi cấy thường có sự biến đổi về hình thái, giải phẫu và sinh lý. Để làm tăng sự sinh trưởng và giảm mức độ chết của cây mô trong giai đoạn huấn luyện, nhiều nghiên cứu đã tập trung kiểm soát cả môi trường vật lý, hoá học và sinh học của cây cấy mô. Trong bài tổng quan này mô tả các stress vô sinh và hữu sinh và các phương pháp đang phát triển hiện tại để huấn luyện cây mô.
Giới thiệu
Nuôi cấy mô thực vật (hay còn gọi là vi nhân giống) đồng nghĩa với sinh trưởng và nhân nhanh của các tế bào, mô và cơ quan của thực vật trên môi trường rắn hoặc lỏng dưới điều kiện vô trùng và điều kiện môi trường có kiểm soát. Vi nhân giống cho phép sản xuất các cây giống chất lượng cao, không nhiễm bệnh và đồng đều mà không phụ thuộc vào thời tiết và mùa vụ. Tuy nhiên, một sự hạn chế quan trọng trong quá trình áp dụng kỹ thuật này để sản xuất cây giống ở quy mô lớn là tỷ lệ chết của cây mô khi được chuyển ra điều kiện tự nhiên là rất cao. Các vi chồi được chuyển ra điều kiện ex vitro sẽ được tiếp xúc với các stress yếu tố vô sinh (nhiệt độ, cường độ ánh sáng, độ ẩm thay đổi) và stress hữu sinh như nấm đất, vì vậy, huấn luyện quyết định đến sự thành công của cả quy trình (Deb và Imchen, 2010). Các nhà nghiên cứu đã tập trung vào kiểm soát các điều kiện môi trường (cả vật lý và hoá học) để huấn luyện cây mô cạnh tranh được với các hệ vi thực vật (Mathur et al, 2008).
Huấn luyện với điều kiện ex vitro
Sự thay đổi về hình thái và sinh lý
Thực vật được nuôi cấy in vitro rất khác biệt so với được nuôi trồng ở ngoài đồng ruộng. Mức độ chết cao đã được quan sát thấy trong quá trình chuyển các vi chồi ra điều kiện ex vitro do thực vật in vitro có lỗ khí không hoạt động, hệ thống rễ yếu và lớp cutin mỏng (Mathur et al, 2008). Cây in vitro được cung cấp nhiều phytohormon thường có hình thái và giải phẫu không bình thường và thường được gọi là hiện tượng thuỷ tinh hoá (dư thừa nước) (Hronkova et al, 2003). Do các đặc tính sinh lý và giải phẫu của cây được vi nhân giống như vậy nên cần thiết phải huấn luyện cây cấy mô thích nghi với môi trường trong nhà kính hoặc ngoài ruộng (Hazarika, 2003). Ở nhiều loài thực vật, bộ lá được hình thành trong điều kiện in vitro không thể phát triển sau khi chuyển ra điều kiện ex vitro và thường được thay bằng bộ lá mới (Preece và Sutter, 1991, Diettrich et al, 1992). Cây được nuôi cấy in vitro có lỗ khí lớn kèm với thay đổi về hình dạng và cấu trúc. Các tế bào bảo vệ thường có thành tế bào mỏng và chứa nhiều tinh bột và lục lạp (Marin et al, 1988). Theo Ticha et al (1999), khi huấn luyện cây thuốc lá với điều kiện tự nhiên làm giảm mật độ, kích thước và hình thái của lỗ khí ở cả hai mặt của lá mới hình thành. Trong suốt giai đoạn huấn luyện, lá thường dày lên, các tế bào mô mềm của lá sẽ biệt hoá thành mô giậu và mô khuyết, mật độ lỗ khí giảm và lỗ khí đổi từ hình tròn thành thành elip. Sự phát triển của lớp cutin, lớp sáp và sự điều hoà hiệu quả hoạt động của lỗ khí dẫn tới sự ổn định của thế năng nước ở cây con trong quá trình huấn luyện ngoài đồng ruộng (Pospóšilová et al, 1999).
Stress của yếu tố vô sinh và sự huấn luyện
Cường độ ánh sáng
Cây mô sinh trưởng trong điều kiện cường độ ánh sáng (1.200-1.300 lux) và nhiệt độ thấp (25±2oC), do vậy, chuyển trực tiếp ra ngoài tự nhiên có ánh sáng mặt trời (4.000-12.000 lux) và nhiệt độ (26-36oC) có thể đốt cháy bộ lá và làm héo cây con. Do đó, cần phải cho cây mô làm quen với điều kiện tự nhiên thông qua một quá trình gọi là tôi luyện (hardening) hoặc huấn luyện (Lavanya et al, 2009). Các bình chứa để nuôi cấy mô có thể được đặt trong nhà lưới với nắp được vặn lỏng. Cây mô được đặt dưới điều kiện ánh sáng bức xạ từ 3-6 ngày để chúng kịp thích nghi với điều kiện môi trường mới. Điều này giúp bán tôi luyện cây con và giúp cây con kéo dài. Chuyển các cây mô từ điều kiện in vitro sang ex vitro dưới ánh sáng trực tiếp cũng là nguyên nhân gây nên hiện tượng quang ức chế (photoinhibition) và diệp lục bị quang phân huỷ (photobleaching). Nghiên cứu cho thấy cây mô Calathea louisae và Spathiphyllum floribundum được tiếp xúc trực tiếp với ánh sáng bức xạ cao thường xảy ra hiện tượng quang ức chế và diệp lục bị phân huỷ (Van Huylenbroeck 1994; 1995). Hiện tượng này không còn thấy khi cây mô thuốc lá được sinh trưởng trong nhà kính khi cây mô thuốc lá được huấn luyện qua hai giai đoạn, giai đoạn nhà lưới (với ánh sáng bức xạ yếu từ 30-90 µmol.m-2.s-1) và sau đó trong không khí (200-1.400 µmol.m-2.s-1) (Pospóšilová et al.1999). Quá trình chuyển từ in vitro sang ex vitro có thể dẫn đến sự suy giảm tạm thời các tham số quang hợp. Tốc độ đồng hóa quang hợp (NAR) ở cây khoai tây và cây pathiphyllum floribundum giảm xuống trong 1 tuần sau khi chuyển ra ngoài huấn luyện và tăng lên sau đó (Pospóšilová et al.1999). Sau khi chuyển cây ra ngoài, sự hấp thụ 14CO2 của các lá cây chưa rụng của cây Fragaria và Rubusidaeus tương tự như lá cây in vitro hoặc chỉ tăng đôi chút, sự gia tăng hấp thụ nguồn cacbon này rõ rệt nhất là ở các lá được hình mới. (Deng và Donnelly, 1993).
Độ ẩm
Quá trình hình thành cutin, chất sáp bề mặt của biểu bì và bộ máy chức năng của lỗ khí chưa hoàn thiện là nguyên nhân dẫn tới tốc độ thoát hơi nước cao ở lá cây mô. Để tránh hiện tượng này, cây mô được chuyển một cách từ từ từ nơi có độ ẩm cao đến nơi có độ ẩm thấp. Các túi chứa cây mô nên để ở nơi có ánh sáng yếu, nắp lọ được nới lỏng và sau khoảng 1-2 tuần mới chuyển sang chậu chứa đất và cát đã khử trùng, các chậu này được che phủ bởi túi nilon. Tốc độ thoát hơi nước qua lỗ khí và lớp cutin một cách từ từ sẽ tạo điều kiện để lớp cutin và lớp sáp phát triển (Pospóšilová et al.1999).
Cho dù thế năng nước của cơ chất cao hơn so với thế năng nước của môi trường có sacarozơ, cây mô có thể héo rũ do lượng nước trong lá bị mất đi không kiểm soát. Hơn nữa, nước cung cấp có thể bị giới hạn do tính dẫn của rễ và sự kết nối giữa thân và rễ chưa tốt (Fila et al. 1998). Nhiều cây mô bị chết trong thời kỳ huấn luyện. Theo Short et al (1987), sinh trưởng tối ưu và tôi luyện cây in vitro của cây bắp cải và cây hoa cúc diễn ra khi cây mô được nuôi cấy trong độ ẩm tương đối là 80%. Bộ lá cây hoa cúc và cây củ cải đường khi được nuôi trong điều kiện có độ ẩm tương đối dưới 100% thì lớp chất sáp phát triển nhanh, chức năng có lỗ khí được cải thiện và giảm sự mất nước của bộ lá (Ritchie et al.1991).
Nồng độ cacbonhydrat
Cây mô phát triển trong bình nuôi cấy dưới điều kiện ánh sáng thấp, trong môi trường chứa hàm lượng đường và dinh dưỡng phong phú cho phép sinh trưởng dị dưỡng với độ ẩm ở mức cao. Các công bố cho thấy rằng hàm lượng cacbinhydrat ảnh hưởng đến quá trình huấn luyện bởi vì cây mô chuyển từ dị dưỡng sang tự dưỡng và bất kỳ xử lý nào trước hoặc sau khi chuyển đều làm tăng khả năng quang hợp của cây, có thể cải thiện khả năng sống của cây (Wainwright và Scrace 1989). Hàm lượng đường saccarozơ 40 g/l được bổ sung vào môi trường nuôi cấy trước khi chuyển chồi cải xoong làm tăng khối lượng chất khô của cây in vitro Wainwright và Marsh 1986). Bhatt và Dhar (2000) công bố rằng quá trình huấn luyện cây mô Bauhinia vahlii, chồi in vitro ra rễ trên môi trường có bổ sung hàm lượng đường saccarozơ trước khi chuyển vào hỗn hợp giá thể trong chậu không làm tăng tỷ lệ sống nhưng lại làm tăng chất lượng chồi. Chiều dài chồi, khối lượng tươi, khối lượng khô của chồi tăng lên rõ rệt so với công thức bổ sung 20, 30 g/l đường saccarozơ. Khi bổ sung lượng đường saccarozơ nồng độ lớn hơn 30 g/l sẽ làm giảm sinh trưởng chồi của cây mô được huấn luyện. Theo Silvente và Trippi (1986) cũng công bố rằng nồng độ đường bổ sung vào môi trường lớn hơn 30 g/l sẽ wcsx chế sinh trưởng chồi của cây Anagalis arvensis.
Chống thoát hơi nước và chậm sinh trưởng trong điều kiện độ ẩm được kiểm soát
Amaregouda et al. (1994) đã phát hiện ra độ bền của lỗ khí ở thực vật được tăng lên khi cây in vitro được xử lý bằng Alar (B-9) nồng độ 1.500 ppm và thủy ngân phenyl axetat (PMA) (20 ppm), trong khí Alachlor (20 ppm), Sunguard (0,02%), China clay (6% w/v) và bột silica (6% w/v) duy trì độ bền của lỗ khí ở mức vừa phải so với đối chứng. Kiểm tra khả năng chống sự thoát hơi nước bằng Aquawiltless, Clear Spray, DC-200, Exhalt 4-10 Folicote, Protec, Vapor Gard và Wiltfruf để giảm sự thoát hơi nước của cây cúc đại đóa và cây cẩm chướng khi chuyển ra ngoài môi trường tự nhiên. Kết quả cho thấy DC-200 có khả năng làm giảm sự thoát hơi nước tốt nhất nhưng nó lại gây bất lợi cho sinh trưởng của cây. Tất cả các vật liệu chống thoát hơi nước còn lại đều không có hiệu quả để duy trì sức trương của cây (Pospóšilová et al.1999). Smith et al. (1990a, b, 1991) đã công bố rằng một số chất làm chậm sinh trưởng của cây có thể được sử dụng trong vi nhân giống để giảm nguy hại do qua trình héo gây ra. Sử dụng paclobutrazol (0,5-4 mg/l) trong môi trường ra rễ cho tháy làm giảm độ mở của lỗ khí, tăng lớp sáp của lớp biểu bì, chồi ngắn hơn và rễ dày hơn, giảm quá trình héo của cây khi chuyênr ra ngoài tự nhiên, và cũng làm tăng hàm lượng diệp lục/đơn vị diện tích lá. Paclobutrazlol ức chế sinh trưởng của chồi và điều hòa một số quá trình trao đổi chất khác nhau ở cây táo. Steffens et al (1985a, b) cũng công bố rằng xử lý bằng paclobutrazol sẽ làm dịch chuyển quá trình đồng hóa từ lá xuống rễ, làm tăng hàm lượng cacbonhydrat ở tất cả các phần của cây táo con, hàm lượng diệp lục, protein tan, các nguyên tố khoáng ở mô lá, tăng hô hấp rễ, giảm polysaccarit thành tế bào và lượng nước bị mất và tích lũy axit abxixic.
Axit abxixic và axit ascobic trong quá trình huấn luyện vi chồi
ABA là một hormon quan trọng đối với quá trình sinh trưởng và phát triển của thực vật, đóng vai trò quan trọng trong cần bằng nước và sự thích nghi của thực vật với stress môi trường bao gồm cả nhiệt độ thấp (Hetherington 2001; Finkelstein và Gibson 2002). Nó được vận chuyển qua mạch gỗ tới chồi, nới nó điều hòa quá trình thoát hơi nước và sinh trưởng của lá (Hronkova et al.2003). Các stress khác nhau cảm ứng sinh tổng hợp ABA và nó được xem như là hormon stress ở thực vật (Tuteja 2007). Adie et al. (2007) cho rằng ABA là tín hiệu quan trọng để thực vật chống lại yếu tố gây bệnh và có ảnh hưởng tới quá trình sinh tổng hợp axit jasmonic (JA) và kích hoạt cơ chế bảo vệ ở Arabidopsis. Vai trò của ABA đối với quá trình chống chịu stress vô sinh cũng được nghiên cứu bởi Aguilar et al. (2000) ở cây cúc vạn thọ, thông qua điều khiểm sự mất nước của bộ lá sự sống sót và sinh trưởng của vi chồi khi chuyển trực tiếp cây mô ra đồng ruộng. Hemavathi et al. (2010) cho rằng axit ascobic được biểu iện ở cây khoai tây thông quá sự biểu hiện của gen L-gulono-ɣ-lactone oxidase (GLOase) và sự tích lũy của axit ascobic làm tăng khả năng chống chịu stress vô sinh của thực vật.
Phương pháp hiệu quả để huấn luyện
Deb và Imchen (2010) đã thông báo một phương pháp để huấn luyện cây hoa lan bằng cách sử dụng cơ chất cải tiến. Cây hoa lan nuôi cấy mô được huấn luyện in vitro bằng cách sử dụng MS 10% không bổ sung nguồn cacbon hoặc bất kỳ chất điều sinh trưởng nào. Trong các bình nuôi cấy với cơ chất khác nhau được sử dụng nhằm tạo môi trường biểu sinh và khô hạn cho cây lan. Cụ thể bổ sung các mảnh than củi (5-6 mm), một mẩu gạch nhỏ và rêu (tỷ lệ 1:1) được cho là thích hợp nhất cho cây lan cấy mô sống biểu sinh và tỷ lệ (1:1) của rêu và gỗ mục kết hợp với một chút mảnh than củi, gạch thích hợp nhất cho sống khô hạn của cây lan. Sau một thời gian, rễ mới hình thành xung quanh các thanh củi. Tương tự, Agnihotri et al. (2004) cũng cống bố rằng 80% cây đu đủ mô sóng ót khi được chuyển từ túi nuôi cấy có bổ sung soilrite sang chậu nhỏ chứa đất vườn với tỷ lệ 1:1.
Hình 1. Thí nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng của giá thể đến quá trình thích nghi của cây lan kim tuyến in vitro với điều kiện tự nhiên (nguồn: TS. La Việt Hồng và cs)
Hình 2. Giai đoạn huấn luyện cây hoa cúc in vitro với điều kiện tự nhiên trong sản xuất (nguồn: TS. La Việt Hồng và cs)
[1] Nguồn: Chandra S, Bandopadhyay R, Kumar V, Chandra R. Acclimatization of tissue cultured plantlets: from laboratory to land. Biotechnol Lett. 2010 Sep;32(9):1199-205. doi: 10.1007/s10529-010-0290-0. Epub 2010 May 9. PMID: 20455074.
.png)
.jpg)